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蛋白質技術專題:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測外源蛋白的表達
點擊次數:129 發布日期:2019-2-26  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
[實驗原理]
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)是蛋白分析中經常使用的一種方法。它是將蛋白樣品同離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)以及巰基乙醇一起加熱,使蛋白變性,多肽鏈內部的和肽鏈之間的二硫鍵被還原,肽鏈被打開。打開的肽鏈靠疏水作用與SDS結合而帶負電荷,電泳時在電場作用下,肽鏈在凝膠中向正極遷移。不同的大小的肽鏈由于在遷移時受到的阻力不同,在遷移過程中逐漸分開,其相對遷移率與分子量的對數間成線形關系。

pGLO是將綠色熒光蛋白(GFP)的基因克隆在阿拉伯糖啟動子之后的一種表達載體。攜帶有pGLO的大腸桿菌在含有相應誘導物和素的條件下培養,可以表達GFP,這比不加誘導物的同樣的大腸桿菌在SDS—PAGE凝膠上要多出一條明顯的條帶。表達的蛋白也可用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,紫光燈下可以看到誘導后的樣品在凝膠上有綠色熒光條帶出現。還可以通過**印跡染色(Western—blotting)的方法,用GFP的抗體檢測表達的外源蛋白。

[儀器、材料和試劑]

(一)儀器
1.垂直板電泳槽及配套的玻璃板,梳子
2.電泳儀
3.干式恒溫培養器
4.微波爐

(二)材料
1. pGLO表達質粒轉化的大腸桿菌的培養物:用阿拉伯糖誘導的和沒有加阿拉伯糖誘導的

(三)試劑
1.1.5mo1/L  Tris-HCl pH 8.8  (已加SDS )
2.0.5mo1/L  Tris-HCl pH 6.8  (已加SDS)
3.10%SDS
4.30%Acr/Bis  29.2g Acr + 0.8gBis,用雙蒸水定容至100mL,過濾備用,4℃存放。
5.10%Ap (-20℃存放)
6.2x樣品緩沖液

0.5mo1/L Tris-HCl pH6.8       2mL
甘油                           2mL
20%SDS                       2mL
0.1%溴酚藍                    0.5mL
2—?—巰基乙醇                 l.0mL
雙蒸水                         2.5mL

7.5x電極緩沖液
Tris      7.5g
G1y     36 g
SDS      2.5g

雙蒸水溶解,定容至500mL,使用時稀釋5倍使用

8.染色液:0.2g考馬斯亮藍R250 + 84mL 95%乙醇 + 20mL冰醋酸,定容至200mL,過濾備用。
9.脫色液: 酒精:冰醋酸:水=7.5:7.5:85

[實驗步驟]

1.裝配做膠用的玻璃板"三明治":做1.0mm厚的膠。選擇兩側的玻璃夾條為1mm的玻璃板,將其夾條面朝上平放在桌面上,把灰色的U形硅膠夾條在上面擺好,然后把帶兩個“耳朵”的凹玻璃放在上面,使U形硅膠夾條平整、服帖地夾在兩塊玻璃板之間。小心地把這玻璃板“三明治”放到“提籃架子”上,用塑料的“楔子”夾緊,注意底部的U形硅膠夾條在夾緊的過程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夾縫加滿蒸餾水,檢驗是否漏,如果漏水必須重裝。
2.配制濃度為12%的分離膠 (凝膠濃度應根據被分離蛋白的分子量進行選擇),配方如下:

雙蒸水                           3.3 mL
1.5mo1/L Tris-HCl (pH 8.8)       2.5 mL
Acr/Big(30%)                   4.0 mL
10% SDS                        100 μL
TEMED                           10 μL
10%AP                          100 μL
總體積                           10 mL (剛好灌制兩塊膠)

混勻后加入兩玻璃夾縫中,并小心在膠面上加入1cm蒸餾水(在膠面上加蒸餾水稱水封,目的是保持膠面平整,并防止膠與空氣接觸,影響膠的聚合),室溫放置,等膠自然凝聚后(此時在膠面與水封之間可見清晰的界限),將水封傾去。這時可以開始配制4%的濃縮膠,配方如下:

雙蒸水                         1.8 mL
0.5mo1/L Tris-HCl pH 6.8       0.75mL
Acr/Bis (30%)                  0.4 mL
10% SDS                        30 μL
TEMED                           5μL
10%Ap                           30μL
總體積                         3.0 mL (夠做兩塊板的濃縮膠)

混勻后加入到"三明治"玻璃板的夾縫中,然后在把1mm的梳子**濃縮膠中,注意在梳子和濃縮膠之間不要留有氣泡。如果發現有較大的氣泡,一定要想法去掉(可以插拔梳子或指彈氣泡處的玻璃等),否則會影響電泳結果。待濃縮膠凝固后,小心拔出梳子。如果發現拔出梳子后形成的加樣孔之間的間隔發生扭曲,用注射器的針頭小心加以整理,使之齊整。

3.培養物SDS-PAGE樣品的制作:同時做L-阿拉伯糖誘導的和未加L-阿拉伯糖的兩個大腸桿菌樣。取培養物1.5mL加到1.5mL小離心管中,12000r/m離心3分鐘,去上清。在離心沉淀中加約等體積的蒸餾水,用槍頭小心地吹打,使充分懸浮,直到沒有明顯的小團塊,然后加入等體積的2×樣品緩沖液,在100℃沸水浴(或干式培養器)中保溫5min。此時如用槍頭吸取樣品,會發現非常粘稠,呈鼻涕狀,這是因為有樣品中含有大量DNA的結果。要用胰島素注射器將樣品從極細的針頭中打出,反復多次才能將DNA分子打斷,使樣品變得不再粘稠為止。將樣品14000r/m離心5分鐘,使不溶物沉淀下來,小心吸取上清加樣。電泳樣品的處理直接關系到電泳結果的好壞,一定要認真做樣,否則跑不出好膠來。

4.瓊脂封底:做好膠后,把玻璃板“三明治”從架子中取出,將兩玻璃板之間的硅膠夾條去掉。去掉夾條后在凝膠的底部會留下一空隙,此空隙要用2%融化的瓊脂填滿,否則在玻璃板浸到電極緩沖液后空隙中的空氣將很難徹底排除掉,電泳時會明顯影響導電,嚴重時會使整個電泳失敗。瓊脂封底時注意不要產生氣泡。

5.電泳槽組裝:封底后將玻璃板“三明治”凹玻璃面向內重新裝到“提籃架子”上,固定好后,將整個部件放到電泳槽的外殼中,然后加電極緩沖液。加液時要使內外槽中的液面基本等高,內槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm,以保證能夠導電,且電場均勻。

6.加樣:按事先設計好的順序與加樣量依次加樣。在樣品的濃度未知的情況下,同一樣品可加一梯度,即每一泳道的加樣量依次減半。這樣,在做第二次電泳時可以其作為參考,正確加樣。蛋白分子量標準可以加在靠中間的加樣孔中,也可加在離邊的第2道處(靠邊的一道樣品往往會明顯跑斜)。

7.電泳:將電泳槽的蓋子蓋上,把電泳槽的兩個電極接到電泳儀上(注意電極不要接錯),然后接通電源。先將電壓調到80V,當樣品進入分離膠時,調節電壓使恒定在150V。當溴酚藍移動到離底部約0.5cm時,關掉電源,停止電泳。將玻璃板從電泳槽中取出,小心地用舊的電話卡撬開兩玻璃板,暴露出膠面。將濃縮膠部分去掉不要,分離膠放到塑料盒中染色。

8.染色和脫色:凝膠在考馬斯亮藍染色液中染色20分鐘(搖床上緩慢振蕩),然后傾去染色液(染色液回收,可反復用數十次),用自來水洗幾下,去掉凝膠上和塑料盒中的染色殘液,加脫色液脫色(搖床上緩慢振蕩),1小時后換一次脫色液,振蕩脫色過夜。徹底脫色后的凝膠蛋白條帶清晰,背景透明干凈。這時可以將凝膠拍照或用掃描儀進行掃描,作為記錄。
來源:上海嘉鵬科技有限公司
聯系電話:021-36162366
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