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蛋白質技術專題:聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度
點擊次數:110 發布日期:2019-2-26  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
(一)原 理
由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制,因此可以形成“連續系統”和“不連續系統”兩種電泳系統。“不連續系統”大的特點在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點是:(1)使用兩種不同濃度的凝膠系統;(2)配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同,并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實驗中,電泳凝膠分為兩層:上層膠為低濃度的大孔膠,稱為濃縮膠或成層膠,配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl,pH6.7;下層膠則是高濃度的小孔膠,稱為分離膠或電泳膠,成膠的緩沖液是Tris-HCl,pH8.9。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸,pH8.3。可見,凝膠濃度、成膠成分、pH與電泳液緩沖系統各不相同,形成了一個不連續系統。
電泳時,蛋白質樣品放置在濃縮膠上,為防止蛋白質樣品在電極緩沖液中擴散,因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合,以提高密度;為觀察蛋白質樣品泳動的情況,樣品中還加入溴酚藍等示蹤染料,這些有色物質的分子比任何一種大分子物質泳動的速度都快,只要染料未泳動出凝膠管,樣品就沒有走出膠管的危險。
在不連續系統中,當接通電源開始電泳時,系統中的甘氨酸、蛋白質、HCl中的氯離子和溴酚藍等均解離為陰離子,形成離子流向陽極泳動。其遷移率取決于離子的電荷數、分子量大小及形狀。然而,當電極緩沖液(pH8.3)中的甘氨酸離子在進入濃縮膠時,它們遇到了比pH8.3低的pH(6.7),pH下降了近兩個單位,幾乎接近于甘氨酸的等電點(5.97),于是甘氨酸的解離度突然降低,所帶電荷量明顯減少,遷移率減慢。血清樣品中個蛋白質成分也進入濃縮膠,pH的改變雖對其解離度有影響,但比對甘氨酸要小得多,其遷移率比甘氨酸要大,而且濃縮膠的膠孔較大對蛋白質分子不會造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離,分子量很小,摩擦力不大,其遷移率比蛋白質、溴酚藍都快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成:甘氨酸<蛋白質<溴酚藍
甘氨酸分子進入濃縮膠后解離度的下降,造成移動離子流的突然缺失,出現電流減小電導率下降。然而,整個電泳系統中其他部分的電流仍維持不變,根據電導及電位梯度成反比(E=I/n,E為電位梯度,I為電流強度,n為電導率)的關系,于是在前導離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個局部高電位梯度區域中的血清蛋白質各成分,在高電場作用下迅速以不同的速度(分子量不同、帶電量不同)泳向前導Cl-離子區域。當到達前導Cl-區域時因不缺少離子,大的電場強度減弱,離子移動速度急速減慢下來,其結果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過這個過程,是蛋白質樣品濃縮了好幾百倍,且蛋白質各成分也按一定的順序排列成層。
當離子流繼續向前,進入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時,蛋白質分子在小孔膠里遇到阻力,遷移率減慢,同時在pH8.9條件下,甘氨酸又充分解離,其帶電量增加,消除了離子流缺失的現象,小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質。凝膠各部分恢復具有恒定的電場強度,蛋白質的分離完全按一般區帶點用方式進行。
由以上的原理可見,聚丙烯酰胺凝膠的不連續電泳主要的優點就是使蛋白質樣品經濃縮膠后,形成緊密地壓縮層進入分離膠。蛋白質各成分預先分開且壓縮成層,可以減少在電泳時,成分間由于自由擴散而造成的區帶相互重疊所帶來的干擾,這樣就提高了電泳的分辨能力。由于這個優點,少量的蛋白質樣品(1-100??g)也能分離得很好,分辨率高使血清蛋白質可獲得近20多個區帶。

(二)試劑和器材
1.測試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG、純化后的IgG。
2.試劑

(1)制備分離膠、濃縮膠有關試劑
① 凝膠緩沖液:稱取1mol/L HCl 48ml,Tris(三羥基氨基甲烷)36.6g,TEMED(N,N,N`,N`-四甲基乙二胺)0.23ml,加重蒸水至80ml使其溶解,調pH8.9,然后加重蒸餾水定容至100ml,置棕色瓶,4℃貯存。
② 分離膠貯液:28%Arc-0.735%Bis儲液:丙烯酰胺(Acr)28.0g,甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.735g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml。過濾后置棕色試劑瓶中,4℃ 貯存,一般可放置1個月左右。
③ 分析純過硫酸胺(AP)(AR) 0.14g加重蒸水至100ml,置棕色瓶,4℃儲存僅能用一周,好當天配制。上述3種試劑用于制備分離膠。
④ 濃縮膠緩沖液:稱取1mol/L HCl 48ml,Tris5.98g,TEMED 0.46ml,加重蒸水至80ml,調pH6.7,用重蒸水定容至100ml,置棕色瓶內,4℃貯存。
⑤ 濃縮膠貯液:稱Acr10g,Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml,過濾后置棕色瓶內,4℃貯存。
⑥ 40%蔗糖溶液(W/V)
⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg,加重蒸餾水溶解,定容至100ml,置棕色試劑瓶內,4℃貯存。

(2)Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液
稱Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml,調pH8.3后,用重蒸水定容至1000ml,置試劑瓶中,4℃貯存,臨用前稀釋10倍。
(3)0.1%溴酚藍指示劑
(4)染色液 染色液種類較多,染色方法也不完全相同。本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250染色液中,含20%磺基水楊酸,其優點是染色、固定同時進行,背景易脫色。0.5%考馬斯亮藍R250的20%磺基水楊酸染色液:考馬斯亮藍0.05g,磺基水楊酸20g,加蒸餾水至100ml,過濾后置試劑瓶內保存。
(5)脫色液 7%乙酸溶液
(6)保存液 甘油10ml,冰乙酸7ml,加蒸餾水至100ml。
(7)1%瓊脂(糖)溶液   瓊脂(糖)1g,加已稀釋10倍的電極緩沖液,加熱溶解,4℃貯存,備用。
3.器材   電泳儀 夾心式垂直板電泳槽。

(三)操作方法

1.安裝夾心式垂直板電泳槽
夾心式垂直板電泳槽操作簡單,不易滲漏。這種電泳槽兩側為有機玻璃制成的電極槽,兩個電極槽中間夾有一個凝膠模,該模由一個上框形凝膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板(梳子)所組成。電泳槽由上儲槽(白金電極在上或面對短玻璃板),下儲槽(白金電極在下或面對長玻璃板)和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠儲液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝:
(1)將上儲槽和固定螺絲銷釘,仰放在桌面上。
(2)將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。
(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲槽上,短玻璃板應面對上儲槽。
(4)將下儲槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘的上儲槽 ,雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽 。
(5)豎直電泳槽,在長玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙,凝固后的瓊脂(糖)中應避免有氣泡。

2.配膠
① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中,凝膠緩沖液(pH8.9)2.5ml,分離膠貯液5.0ml,重蒸餾水2.5ml,充分混勻,抽氣10min,后加AP 10 ml。
② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA:濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3.制備凝膠板
不連續體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ,凝膠制備應分2步進行。

① 分離膠的制備:根據實驗要求,選擇終丙烯酰胺的濃度,本實驗需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液,其加膠方式不同于連續系統。混合后的凝膠溶液,用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內,加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約3-4mm)用于隔絕空氣,使膠面平整。為防止滲漏,在上、下儲槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠完全聚合,則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。用濾紙條吸去多余的水,但不要碰破膠面。如需預電泳,則上、下儲槽的蒸餾水倒去,換上分離膠緩沖液,10mA電流電泳1h,終止電泳后,棄去分離膠緩沖液,用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數次,即可制備濃縮膠。

② 濃縮膠制備:濃縮膠為pH6.7 25% PAA,混合均勻后用細長的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內(即分離膠上方),距短玻璃板上緣0.5cm處,輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲槽中加入蒸餾水,但不能超過短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處,用日光燈或太陽照射,進行光聚合,但不要造成大的生溫。在正常情況下,照射6-7min,則凝膠由蛋黃透明變成乳白色,表明聚合作用開始。繼續光照30min,使凝膠聚合完全。光聚和完成后放置30-60min,輕輕取出樣品槽模板,用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體,加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒過玻璃板約0.5cm,即可加樣。

4.加樣
作為分析用的PAGE加樣量僅需幾微克,2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區帶。為防止樣品擴散,應在樣品中加入等體積40%蔗糖(內含少許溴酚蘭)。用微量注射器取5ul上述混合液,通過緩沖液,小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部,待所有凹形樣品槽內都加了樣品,即可開始電泳。

5.電泳
將直流穩壓電泳儀的正極與下槽連接,負極與上槽連接(方向切勿接錯)。接通冷卻水,打開電泳儀開關,開始時將電流調至10 mA 。待樣品進入分離膠時將電流調至20-30mA。當藍色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時,將電流調回到零,關電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中,4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲,取出硅橡膠框,用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移去,在膠板一端切除一角作為標記,將膠板移至大培養皿中染色。

6.固定,染色
本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250(內含20%磺基水楊酸)染色液,染色與固定同時進行,使染色液沒過膠板,染色30min左右。

7.脫色
用7%乙酸侵泡漂洗數次,直至背景藍色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床,則可縮短褪色時間。脫色液經活性碳脫色后,可反復使用。
 
來源:上海金鵬分析儀器有限公司
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